2Е уравнение Сведберга
Осталась последняя проблемная величина – УПО.
Нобелевку Сведбергу дали в том числе и за это.
На самом деле, практического применения такой способ определения М не имеет. Особенно сейчас, когда есть более прогрессивные методы.
Что в таком методе плохо?
Нам нужно создать равновесную систему. Есть белок, и сколько такого белка потребуется для эксперимента даже в очень маленькой пробирочке?
Если разница концентраций такая, что мы ее можем достоверно зарегистрировать, то в зоне высоких концентраций белок образует нерасворимые агрегаты, т.к. концентрация слишком высока.
Но в принципе для определенных М можно применять равновесное центрифугирование, и редко, но используют. Чаще сейчас ее используют для создания градиента, для определения плотности веществ, в варианте, когда центростремительное ускорение полностью обеспечено силой Архимеда.
КАКАЕ свойства веществ мы можем определять
плотность (изопекническое ц/ф, создаем градиент плотности, и какое положение в нем займет наше вещество. Fтр вклад не вносит)
коэффициенты седиментации (сейчас есть КС почти для всего, даже для надмолекулярных структур.)
Урановые центрифуги в шахтах – требуют запретить.
Легенда о первой советской центрифуге, построенной Сведбергом, в подвале Курчатовского института
Скоростная седиментация
А. объемная скоростная
В 1-й пробирке все разделяемые компоненты. Более тяжелые, естественно, опускаются первыми
Компоненты однородного образца движутся ко дну с разными скоростями. Неполное разделение: легкие частицы придонных слоев осаждаются раньше тяжелых из поверхностных;
Очистка легких компонентов от тяжелых, когда осадок обычно не нужен. Но со временем легкие компоненты тоже уходят в осадок!
Хороший метод очистки жидкостей от тяжелых компонентов, которые не образуют истинных растворов и имеют ↑КС.
Если очистка легких от тяжелых, то часть легких теряем, засчет того, что изначальные расстояния между частицами и до дна были небольшими. Когда потери несущественны, можно использовать
А если нужно отделить все? И если в том нужен числе чистый осадок?
Б. Зональная скоростная седиментация
Образец наслаивается в виде зоны. Чаще всего используется наслаивание на среду с градиентом плотности для уменьшения конвекции и расширения диапазона разделения;
Может произойти разделение зон еще до того момента, как частицы достигли дна.
Минус – более сложные манипуляции по постанове эксперимента.
И меньшая нагрузочная способность.
Например, выделить вирусы из клеток, а попутно можно отделить целые клетки, ядра и т.д.
Изопикническое (равновесное) центрифугирование
в градиенте плотности, охватывающем диапазон плотностей разделяемых частиц.
С 
оздать градиент можно с помощью равновесного ц/ф: сначала долго ц/ф раствор веществ, из которых мы хотим создать градиент, а потом нанести нашу смесь. Можно создать градиент заранее, используя градиент миксера, например. Обычно используется преформированный градиент из 2-х ступеней, концентрированный раствор веществ, градиент и растворитель, и некоторое время ц/ф. Или это центрифугирование идет одновременно с разделением.
Главное не допустить осаждения на дно интересующих нас веществ, пока градиент не создан.
Типы градиентов: полностью или частично преформированные либо создаваемые в процессе центрифугирования.
Каке в-ва используются для создания градиента?
Для начала надо рассмотеть плотности веществ, которые мы хотим разделять
Надмолек комплексы – менее плотные.
Для НК можно использовать соли тяжелых щелочных металлов или соли тяжелых галогенов, или и то, и другое. Недопустимо для надмолекулярных комплексов – т.к. это сильные хаотропные агенты, и просто приведут к разрушению комплексов.
Чтобы получить большие плотности, на основе сахаридов было разработано несколько веществ специально для формирования градиентов плотности.
«Нам нельзя ничего такого страшного, ионогенного и хаотропного»
Чтобы не увеличивать УПО, введем несколько тяжелых атомов, а для того, чтобы удобнее было их вводить, введем бензольное кольцо. Плюс несколько заместителей, чтобы вещество было стабильным, незаряженным и гидрофильным.
Можно использовать макроскопические частицы, т.к. при ц/ф нет ограничений на размер частицы. Для создания градиентов можно использовать не истинные растворы, а суспензии очнь мелких частиц.
Например, фекол (коммерческое название), по сути мелкодисперсные частицы кремния, покрытые гидрофильной оболочкой, которая обеспечивает стабильность существования такой системы. Percoll (10-20мкм SiO2 + поливинилпироллидон)
Раньше изопикническое ц/ф использовалось для получения чистых суперскрученнных плазмид. – минус в том, что использовался EtBr с УФ, что портило ДНК.
Если ьудем проводить ц/ф разных форм ДНК в присутствии EtBr, тот будет интеркалировать, а коэффициент интеркаляции сильно меняется в завиимости от того, есть супервитки, или нет. Если есть топонапряжение, EtBr может интеркалировать значительно больше. И уменьшается плавучая плотность, т.к. он сам легкий. И плотность релаксированной формы и сперскрученной будет сильно различаться, с помощью визуализации это можно выявить. Зону можно отбрать с помощью шприца.
Но потом его надо извлечь.
Можно использовать даже для выдел органелл – митохондрий,хлоропластов. Их плавучая плотность отличается от плотности остатков разруш клеток. А плавучую плотность использовать удобно, процесс равновесный, похоже на равновесные процессы, где происходит самофокусирование (например, изотахофорез).
А хроматин имеет очень высокую плотность – ядра тоже легко выделять. Даже градиент не требуется, только подушка. Ядра в осадке, остальные органеллы на подушке.
Очень неплотная фракция – мембраны. Хлороплаты и митохондрии (геномсодержащие) примерно посеридине.
Можно использовать комбинацию изопекнического и скоростного ц/ф.
А рибосомы где? Их трудно от хроматина очистить. Можно отделить зональным скоростным ц/ф. Или можно сначала полисомы выделить. Или изопикническим можно отделить неразрушенный ЭПР.
Ц/ф уникально тем, что можно использовать любые буферы.
Нужно обеспечить пост центростремительное ускорение – главное, что требуетсяот центрифуг. Т.е. обеспечить контроль над угловой скоростью вращения пробирок.
Сведберга не было в проекте, а ц\ф были. Американский патент 1892 года – для разделения сливок и масла из молока. «Шарманка с ручкой»
Ротор – сама важная часть, куда мы помещаем образцы
Привод. Обеспечивает контроль над угловой скоростью. В первых центрифугах это был «шарманщик». Кроме того, контроль над разгоном и торможением.
Корпус. Если ротор окажется непрочным и корпуса не будет, оператор пострадает. «Шрапнель»
Температуру тоже надо контролировать – холодильник и камера охлаждения. Треньем о воздух нельзя пренебрегать, выделяется тепло. В совсем хороших ц/ф даже ротор охлаждается.
И еще вакуумный насос.- для неаналитич ц\ф.
Сейчас аналитическими обозначают маленькие настольные ц/ф для нельших порций вещества, в противовес препаративным.
В одном из институтов в Ельцовке стоит такой монстр – советская аналитическая ультра ц/ф. Вынести ее трудно, вот и стоит. Это устройство тех времен, когда денег, тем более на науку, не считали.
Сейчас это никому не надо, можно довести эксперимент до равновесия, а потом просто пропустить чрез спектрофотометр перистальтическим насосом, отбирая отдельные фракции из пробирки. Это дешевле.
Полностью экипированную называют ультра.
Наши – маленькие, попроще. Настольные. Называют тоже аналитическими, но зачение другое.
Поллупрепаративные, куда можно поместить стаканы больших объемов.
В больших центрифугах ротор никак не крепится, а просто держится на стержне. Вот это баланас!
Скорость вращения – до 100000 g. У космонавтов перегрузка – до 10 g.
Проточная центрифуга часто используется в промышленности (непрерывная подача материала в процессе эксперимента) В каждом фермерском хозяйстве – сепаратор. Отделение жира от молока.
Промышленные, проточные осадительные, система «жидкость-твердые тела» – отгон жидкостей от осадка, например, в горно-обогатительной прмышленности.
Фильтрующая ц\ф. Имеет вставки – фильтры, для очистски от мелких частиц. Размеры пор заданы под размеры частиц.
Осветляющая. Фильтр жидкости. Например, в ЗИЛ-е, он гудит после долгой езды, там подобная ц/ф для очистки масла. После выключения двигателя она еще долго останавливается.
Скорость зависит от размера радиуса движения, и по мере приближения ко дну частицы ускоряются – отношение макс радиуса и мин радиуса характеризует неоднородность поля центростремительного ускорения, по длине пробирки. При чем, чем меньше неоднородность, тем лучше.
Иногда в зональной скоростной используются градиенты плотностей, но это не делает ц\ф изопикническим. Неоднородность используется просто для замедления, чтобы недать частицам осесть на дно и болееэффективно разделить.
Большая Энциклопедия Нефти и Газа
Коэффициент седиментации представляет собой скорость оседания при ускорении центробежной силы, равном единице. Коэффициент седиментации повышается с увеличением молекулярного веса и уменьшается с ростом коэффициента поступательного трения при увеличении степени асимметрии молекул растворенного вещества. [2]
Коэффициенты седиментации при помощи таких ячеек определяются также по графику зависимости gx от t, как описано выше. Величина х и в этом случае соответствует расстоянию от вершины пика до оси вращения. [6]
Коэффициент седиментации этого продукта в среднем составляет примерно 45S ( рис. 8.10, а), а его дифрактограмма и размер кристаллитов почти такие же, как у ферритина с низким содержанием железа. [7]
Коэффициент седиментации S в общем случае зависит от концентрации С ( подробней см. стр. [11]
Обычно коэффициент седиментации ( s) приводят к константе седиментации ( s2o, w), соответствующей величине s в воде при 20 С ( фиг. [12]
На коэффициент седиментации существенное влияние оказывает концентрация раствора полимера. [13]
Если коэффициенты седиментации компонентов отличаются сильно ( скажем, в три раза и больше), то хорошее разделение достигается при ультрацентрифугировании в угловом роторе. Оно широко применяется на первых этапах фракционирования при больших объемах исходного раствора. Для лучшего разделения часто проводят повторное фракционирование. Когда величина коэффициента седиментации, скорректированная в соответствии с условиями препаративного эксперимента, примерно известна, возникает вопрос о выборе ротора, скорости и длительности вращения. [14]
Расчет коэффициентов седиментации по данным экспериментов более общего характера, проведенных методом скоростной седиментации, с учетом диффузии требует более сложного решения уравнения Ламма. [15]
коэффициент седиментации
Смотреть что такое «коэффициент седиментации» в других словарях:
коэффициент седиментации — Показатель скорости осаждения микрочастиц при центрифугировании; К.с. измеряется в единицах S (по имени Т. Сведберга, сконструировавшего в 1923 первую центрифугу): 1S=110 13 сек.; в одном и том же растворителе при одной и той же температуре К.с.… … Справочник технического переводчика
коэффициент седиментации — sedimentacijos koeficientas statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Koeficientas, apibūdinantis dalelių nusėdimo spartą centrifuguojant. atitikmenys: angl. sedimentation coefficient vok. Sedimentationskoeffizient, m rus.… … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas
коэффициент седиментации — sedimentacijos koeficientas statusas T sritis chemija apibrėžtis Koeficientas, apibūdinantis dalelių nusėdimo greitį centrifuguojant. atitikmenys: angl. sedimentation coefficient rus. коэффициент седиментации … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
коэффициент седиментации — sedimentacijos koeficientas statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis Rodiklis, rodantis mikrodalelių nusėdimo greitį. atitikmenys: angl. sedimentation coefficient rus. коэффициент седиментации … Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas
Седиментации коэффициент S — Седиментации коэффициент, S * седыментацыі каэфіцыент, S * sedimentation coefficient or S показатель скорости осаждения микрочастиц при центрифугировании (см.). Единицей С. к. является S, равная 1 Ч 10 13 с. С. к. зависит от массы, формы и… … Генетика. Энциклопедический словарь
Рибосомальные рибонуклеиновые кислоты — Рибосомные рибонуклеиновые кислоты (рРНК) несколько молекул РНК, составляющих основу рибосомы. Основной функцией рРНК является осуществление процесса трансляции считывания информации с мРНК при помощи адапторных молекул тРНК и катализ образования … Википедия
Рибосомные рибонуклеиновые кислоты — (рРНК) несколько молекул РНК, составляющих основу рибосомы. Основной функцией рРНК является осуществление процесса трансляции считывания информации с мРНК при помощи адапторных молекул тРНК и катализ образования пептидных связей между … Википедия
РРНК — Рибосомные рибонуклеиновые кислоты (рРНК) несколько молекул РНК, составляющих основу рибосомы. Основной функцией рРНК является осуществление процесса трансляции считывания информации с мРНК при помощи адапторных молекул тРНК и катализ образования … Википедия
Рибосомальная РНК — Рибосомные рибонуклеиновые кислоты (рРНК) несколько молекул РНК, составляющих основу рибосомы. Основной функцией рРНК является осуществление процесса трансляции считывания информации с мРНК при помощи адапторных молекул тРНК и катализ образования … Википедия
Рибосомальные РНК — Рибосомные рибонуклеиновые кислоты (рРНК) несколько молекул РНК, составляющих основу рибосомы. Основной функцией рРНК является осуществление процесса трансляции считывания информации с мРНК при помощи адапторных молекул тРНК и катализ образования … Википедия
5.1 Методы ультрацентрифугирования
В случае, когда скорость диффузии за счет теплового движения частиц значительно меньше скорости осаждения под действием центробежного поля, можно непосредственно измерять скорость седиментации частиц. При этом в растворе, первоначально гомогенном, вследствие осаждения частиц образуются две области: область чистого растворителя и область раствора, содержащего исследуемые частицы (для биополимеров растворителями обычно служат солевые и буферные водные растворы). Между этими областями имеется переходная зона (граница), в которой концентрация полимера плавно изменяется от нуля до некоторого максимального значения. Наблюдение скорости перемещения этой границы лежит в основе метода скорости седиментации. В реально наблюдаемой переходной зоне концентрация никогда не изменяется резко и зона имеет конечную ширину. Она размывается, вопервых, вследствие диффузии осаждаемых частиц, во-вторых, за счет полидисперсности препаратов по молекулярному весу в результате осаждения разных частиц с разными скоростями. В этом случае по величине размытия границы возможна оценка степени полидисперсности исследуемого образца. Важной разновидностью метода скорости седиментации является метод осаждения в градиенте плотности.
При относительно небольших центробежных ускорениях поток седиментирующего вещества оказывается сравнимым по величине с потоком вещества в противоположную сторону, вызванным диффузией, так что граница между раствором и растворителем не образуется, а происходит лишь некоторое перераспределение концентрации в кювете. Очевидно, концентрация исследуемого вещества в верхней, обращенной к оси вращения части кюветы меньше, чем концентрация в исходном растворе. Ближе ко дну кюветы концентрация, наоборот, возрастает, превышая исходную. При достаточно длительном времени центрифугирования устанавливается равновесие потоков вещества в каждой точке и образуется равновесное распределение вещества по длине кюветы. По форме установившегося распределения можно судить о свойствах исследуемых частиц, в частности об их молекулярном весе.
Те же самые сведения, но с несколько меньшей точностью, можно получить, анализируя распределение концентрации в кювете в начальной стадии установления равновесия. Этот метод, называемый методом приближения к равновесию (метод Арчибальда), широко применяется в практике. К методу седиментационного равновесия можно также отнести метод равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности. При длительном ультрацентрифугировании концентрированных растворов низкомолекулярных солей (таких, как CsCl, Cs 2 SO 4 ацетат цезия, RbBr, KBr и др.) возникает градиент плотности за счет перераспределения концентрации солевого раствора. Макромолекулы, находящиеся в таком растворе, через некоторое время располагаются в узкой зоне, где локальная плотность растворителя соответствует плотности этих макромолекул. Этот метод позволяет проводить фракционирование макромолекул по их плотности, оценить гетерогенность изучаемого образца по плотности, а также его молекулярный вес. Это перечисление хорошо демонстрирует гибкость метода ультрацентрифугирования и его возможности в исследовании макромолекул.
0,1° и измеряется с точностью
0,02°. Ультрацентрифуги снабжаются разнообразными роторами, отличающимися размерами, количеством и емкостью пробирок. Аналитический ротор имеет обычно два отверстия-гнезда для аналитической кювёты и ее противовеса диаметром
5.2 Метод скорости седиментации
Метод скорости седиментации и его разновидности широко применяются как для исследования свойств макромолекул в растворе, так и для разделения веществ. Основной измеряемой величиной в этом методе является коэффициент седиментации, который зависит от формы макромолекулы в данном растворе и от молекулярного веса.
Движение макромолекулы в центробежном поле происходит поддействием равнодействующей центробежной силы V ρ M ω 2 x и выталкивающей силы
плотность растворителя больше плотности молекулы.
Равнодействующая центробежной силы и силы Архимеда уравновешивается силой вязкого трения:
